|
|
Biomedical applications of polycaprolactone nanofibrous mats
Dvořák, Pavel ; Přibyl,, Jan (referee) ; Zajíčková, Lenka (advisor)
The diploma thesis deals with the treatment of polycaprolactone (PCL) nanofibers. PCL fibers were subjected to the deposition of plasma amine polymers in a low pressure pulsed radiofrequency capacitively coupled discharge using cyclopropylamine monomer (CPA). Collagen as an extracellular matrix (ECM) protein was immobilized and cell proliferation on the modified nanofiber surface was monitored. Untreated PCL fibers were also subjected to the deposition of an antibacterial copper layer, and the fibers were characterized by scanning electron microscopy (SEM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), and energy dispersive spectroscopy (EDX).
|
|
|
Monitoring of mesenchymal stem cell migration in the extracellular matrix
Zumberg, Inna ; Čmiel, Vratislav (referee) ; Chmelíková, Larisa (advisor)
This master’s thesis contains a description of mesenchymal stem cells (MSC). The work includes knowledge about the process of migration and differentiation of MSCs. The theoretical part of this thesis also deals with the problem of cell cultivation in 2D and 3D environments. The most used materials for creating 3D scaffolds are described here. The practical part contains the description of the cell culture protocol for passaging and also describes the experiment in the cell laboratory. The results of the experiment are discussed using confocal microscope images. The proposed experiment was tested with a sufficient number of repetitions. The processing of microscopic images was performed in the MATLAB programming environment.
|
|
|
Determination of collagen degradation degree using spectroscopy
Fišerová, Kateřina ; Márová, Ivana (referee) ; Vojtová, Lucy (advisor)
Předložená diplomová práce se zabývá charakterizací vlastností kolagenu po působení různých fyzikálních a chemických podmínek. Jejím cílem je popsat změny struktury kolagenu způsobené jeho modifikací, zhodnotit dopad těchto změn na další použití kolagenu a výběr vhodné metody pro determinaci vlastností kolagenu. V literární rešerši je popsána chemická struktura kolagenu, jeho využití jako biomateriálu, stabilita kolagenu a způsoby určení stupně porušení nativní kolagenní struktury. V experimentální části jsou vodné roztoky hovězího kolagenu typu I modifikovány působením různých podmínek - různé intenzity a délky dezintegrace (1 minuta při 6 000 otáčkám až 5 minut při 14 000 otáčkách), různé teploty přípravy (4 °C, pokojová teplota a 30 °C), různou dobou přípravy (1 až 5 dní), působením světla (1 až 14 dní) a úpravou pH (4 až 8). Za účelem popsání struktury kolagenu a změn, k nimž došlo během modifikace kolagenních vzorků působením různých podmínek jsou kolagenní roztoky analyzovány UV VIS spektrometrií a infračervenou spektrometrií. UV-VIS spektrometrií byly analyzovány barevné produkty reakce volných aminoskupin přítomných v kolagenu s vhodným činidlem. Jako činidlo byl použit vodný roztok kyseliny 2,4,6 trinitrobenzensulfonové a roztok ninhydrinu v alkoholu. V případě FT-IR spektrometrie byly kolagenní vzorky analyzovány buď v podobě KBr tablet nebo pomocí ATR techniky v podobě filmů. Pro vyhodnocení změn ve struktuře kolagenu byla využita dekonvulace amidu I, jednoho z charakteristických pásů v infračerveném spektru kolagenu, který leží v oblasti 1590 - 1720 cm-1. Na základě snímků pořízených pomocí SEM byla porovnána morfologie kolagenních vzorků. V souladu s teoretickými předpoklady bylo zjištěno, že k nejvýraznějšímu porušení kolagenní struktury dochází při dlouhodobém stání kolagenního roztoku na světle. Podstatné změny způsobuje i zvýšení teploty a téměř žádný vliv na strukturu kolagenu nemá intenzita dezintegrace kolagenního roztoku. V případě zvýšení pH, byly vzorky do pH 5 stabilní a homogenní, ale poté docházelo k oddělení kolagenní fáze a srážení kolagenu, což ovlivnilo a zkreslilo UV-VIS analýzu. Nejlepších vlastností dosahují vzorky zamražené čerstvě po přípravě, dezintegrované 4 minuty při 14 000 otáčkách při 30 °C a beze změny pH. Na základě výsledků analýz se jako vhodné metody pro stanovení stupně porušení kolagenní struktury ukázala UV VIS spektrometrie s využitím kyseliny 2,4,6 trinitrobenzensulfonové v kombinaci s infračervenou spektrometrií kolageních filmů.
|
|
|
Collagen cross-linking using oxidized cellulose
Filka, Pavel ; Márová, Ivana (referee) ; Vojtová, Lucy (advisor)
Předložená diplomová práce v teoretické části shrnuje základní fakta o kolagenu, bílkovině, která je nejrozšířenější v lidském organismu a oxidované celulóze používané v medicíně po několik desetiletí. Hlavním tématem této časti je síťování kolagenu, které je důležitým faktorem pro stabilizaci kolagenu podporující odolnost proti jeho degradaci. Jako síťující činidlo lze použít právě oxidovanou celulózu, která má kromě hemostatického účinku i funkční karboxylové skupiny vhodné k síťování proteinů. Praktická část práce byla zaměřena na sledování vzájemného chování směsí roztoků oxidované celulózy a kolagenu. Filmy či pěnové lyofilizáty připravené z těchto polymerních směsí by mohly sloužit jako účinná hemostatika nebo jako antibakteriální krytí ran podporující hojení. Byla zvolena řada hmotnostních poměrů mezi kolagenem a oxidovanou celulózou (9:1, 3:1, 5:3, 1:1, 1:2, 1:3, 1:9) se zachováním konstantního množství kolagenu, ale se vzrůstajícím množstvím celulózy. Jejich schopnost chemicky se vázat a umožnit tak vznik amidových vazeb mezi volnými aminovými skupinami kolagenu a karboxylovými skupinami oxidované celulózy byla sledována pomocí dvou UV-VIS spektroskopických metod, které využívají barevné reakce chemického činidla (ninhydrinu či 2,4,6 trinitrobenzensulfonové kyseliny) se zbylými volnými aminovými skupinami kolagenu. Karboxylové skupiny oxidované celulózy byly navíc aktivovány jak v polymerním roztoku tak i ve formě filmu směsí činidel 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu a N hydroxysukcinimidu (EDC/NHS). Pomocí infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací (FT-IR) byly vyšetřeny změny vzorků na úrovni sekundární struktury kolagenu. Stabilita připravených směsí byla sledována ve formě filmu pomoci hydrolytické degradace při 37 °C. Morfologické změny na dvou typech lyofilizovaných vzorků, vymražených rychle při 196 °C nebo pomaleji při -30 °C, byly sledovány pomocí rastrovací elektronové mikroskopie (SEM). Při přípravě polymerních směsí se obě složky (kolagen i celulóza) se vzrůstajícím obsahem celulózy srážely až do poměru 1:1. UV-VIS analýzy potvrdily pokles volných –NH2 skupin poukazující na síťování kolagenu s celulózou shodně s nárůstem odolnosti vůči hydrolytické degradaci získané z měření úbytků hmotností připravených filmů. Od poměru 1:2 se složky již nesrážely, polymerní roztok byl homogenní, ale z důvodu nárůstu počtu volných aminových skupin od tohoto poměru výše lze usoudit, že celulóza fungovala v malém obsahu pouze jako fyzikální síťovalo a po dosažení rovnovážného stavu s kolagenem funguje spíše jako rozpouštědlo. Tímto způsobem zřejmě mohlo dojít ke změnám kolagenu až na úrovni sekundární struktury zaznamenané pomocí FT-IR. Aktivace karboxylových skupin celulózy činidly EDC/NHS nebyla prokázána. Poměry složek ovlivnily i porozitu a velikosti pórů připravených lyofilizátů určených pomocí SEM. Do poměru 1:1 byla porozita skafoldů vymražených kapalným dusíkem mezi 46 – 60 %, po dalším přidání celulózy stoupla až na 81 % (u poměru 1:9). Průměrná velikost pórů samotného kolagenu byla velice malá (14 ± 5 m), oproti oxidované celulóze (79 ± 24 m), proto přídavek celulózy vždy zvýšil velikost pórů na cca 55 m s výjimkou poměru 1:9, mající vysokou průměrnou velikost pórů (186 ± 76 m) a velmi pravidelnou strukturu připomínající včelí plást, kterou má i samotná celulóza.
|
|
| |
|
|
Effect of crosslinking on the denaturation of collagen samples from different animal sources
Ladický, Peter ; Muchová, Johana (referee) ; Sedláček, Petr (advisor)
The diploma thesis deals with the preparation, crosslinking and characterization of collagen films from various animal sources. Collagen from pig, Tilapia, horse, cow and crocodile was used to prepare collagen films. Chemical crosslinking agents EDC/NHS and Lyofix were used to crosslink the prepared films. In the experimental part, differential scanning calorimetry (DSC) method was optimized to determine the denaturation temperature of individual collagen films before and after crosslinking. In addition, the ability of films to swell and degrade has been analyzed. The presence of characteristic groups present in the collagen structure was verified using infrared spectroscopy. The sample morphology was analyzed using Scanning Electron Cryomicroscopy (Cryo-SEM). The results show that EDC/NHS is a better collagen crosslinking agent compared to Lyofix. The best source for the preparation of thermally stable films is piggy collagen, whose denaturation temperature after crosslinking with EDC/NHS was about 69 °C and could represent more than adequate substitution for cow collagen, which is currently most used in the field of tissue engineering and food industry.
|
|
|
Atelocollagen separation and characterization
Konečná, Zuzana ; Zubal, Lukáš (referee) ; Vojtová, Lucy (advisor)
The aim of the presented bachelor thesis was to optimize separation of soluble atelocollagen out of commercially available bovine collagen and its characterization. Collagen went through an enzymatic digestion using pepsin as a protease and subsequently purified by filtration, centrifugation and dialysis. Obtained samples were characterized using infrared spectrometry, polyacrylamide gel electrophoresis and Hartree-Lowry assay for total protein determination. Suitable digestion time range to gain sufficient yields was decided from 60 – 70 hours at pepsin/collagen weight ratio 1:25. Highest yield (72.6 %) was obtained at mentioned ratio after 66 hours of reaction. Sufficient filtration, which was decisive for final product purity, was assured by combination of several filtration techniques with centrifugation. Quality of prepared product according to their molecular weight was characterized by gel electrophoresis. Solubility and its dependence on pH and NaCl concentration in solution were measured by Hartree – Lowry assay. Ratio between helical collagen and denaturated collagen was measured by infrared spectroscopy. Obtained spectra yet did not seem fully reliable and provided only a rough estimate. More accurate information about structure could be achieved by using circular dichroism spectroscopy.
|
|
|
Rheology of collagen hydrogels and its nanocomposites
Voldánová, Michaela ; Vojtová, Lucy (referee) ; Jančář, Josef (advisor)
This bachelor thesis deals with the phenomenological description of the rheological behavior of pure collagen I and its nanocomposites with addition of hydroxyapatite in four concentrations. Measurements were performed on a rheometer in the configuration cone – plate for a range of shear rates from 0 s-1 to 100 s-1 under defined conditions. At 4 °C, the collagen in samples of a specific composition remains dissolved; collagen retains his native character and the precursors of hydrogel are in the liquid state. By heating the aqueous solution of collagen with neutral pH leeds to spontaneous crosslinking process into fibrillar structure. At 37 °C, fibrils grow into the gel structure, however, the rate of its formation is dependent on the amount of collagen fibers. The measured data are processed in the form of flow and viscosity curves, from which the rheological behavior of the sample or structural and transformational changes in response to mechanical stress and temperature changes are evaluated and compared. This knowledge can be used to manipulate with hydrogels. Generally, it can help as a basis for further development of collagen, its interaction with HAP and factors influencing their stability or effectiveness.
|
|
|
Preparation and characterization of nanostructured resorbable substitutes for accelerated skin healing
Kacvinská, Katarína ; Muchová, Johana (referee) ; Vojtová, Lucy (advisor)
Spolu s narastajúcimi nárokmi na kvalitu liečby v oblasti popálenin a plastickej chirurgie existuje možnosť ako uplatniť nové technologické riešenie na liečbu porúch s celkovou stratou kožnej vrstvy. Diplomová práca sa zaoberá prípravou nanoštrukturovaného, dvojvrstvového skafoldu pre využitie v tkánivovom inžinierstve, ktorý nahrádza kožnú časť dermis (dolná porézna vrstva) a bazálnu membránu (horná a tenká nanovlákenná vrstva). Zákaldom dolnej pórovitej vrstvy je kolagén, charakterizovaný v prítomnosti ďalších polysacharidových aditív: chitosan, vápenatá soľ oxidovanej celulózy (CaOC), sodná soľ karboxymetylcelulózy (NaCMC). Zároveň prídavok dopamínu a fibroblastového rastového faktoru (FGF), s cieľom zlepšiť biomechanické vlastnosti, regulovať a podporovať hojenie kože. Tenká nanovlákenná vrstva je zložená zo želatíny, polycaprolaktónu (PCL) a CaOC. Sú navrhnuté dva rôzne mechnizmy prípravy skafoldu, ktoré sa odlišujú sa v prítomnosti sieťovaných a nesieťovaných nanovláken. Skafoldy boli charakterizované z hľadiska biomechanických, štruktúrnych vlastností a in vitro. Vrchná nanovlákenná vrstva poskytuje mechanickú podporu, ktorá je výrazne zvýšená prítomnosťou polydopamínu (PDA). Test botnania poréznej vrstvy skafoldu ukázal na dostatočne veľké póry, umožňujúce filtráciu buniek. Táto botnatosť bola znížená v prítomnosti PDA, ktorý má zároveň významný vplyv na časové predĺženie degrádácie v prítomnosti kolagenázy a lyzozýmu. Spolu s FGF výrazne podporil proliferizáciu a životaschopnosť myších fibroblastov. Nanoštrukturovaný, dvojvrstvový skafold má potenciál pre budúce aplikácie pri hojení rán, kedže sa vyznačuje dobrými mechanickými vlastnosťami a umožňuje bunkám adherovať, proliferovať a formovať extra celulárny matrix.
|
|
|
Novel Antibacterial Collagen Scaffolds for Regenerative Medicine
Dorazilová, Jana ; Brtníková, Jana (referee) ; Vojtová, Lucy (advisor)
Tato diplomová práce se zabývá charakterizací 3D porézních kolagenových pěn obsahující vybraná antibakteriální činidla. V literární části jsou shrnuty dosavadní poznatky o biomateriálech a biopolymerech se zaměřením na kolagen a chitosan. Dále jsou v ní popsány antibakteriálních vlastnosti nanočástic v kontextu s využitím selenových nanočástic jako antibakteriální činidla. Pro potřeby této práce byla vybrána antibakteriální aditiva dvojího typu – biopolymerní chitosan a selenové nanočástice. 3D porézní struktury bylo dosaženo metodou lyofilizace. Mechanické vlastnosti biopolymerní matrice byly podpořeny síťováním v prostředí chemického síťovadla na bázi karbodiimidu. K charakterizaci připravených kolagenových pěn byly použity především fyzikálně chemické metody. Na analýzu mikrostruktury a velikosti pórů, vizualizaci nanočástic a jejich distribuci v testovaných materiálech byla využita rastrovací elektronová mikroskopie (SEM) spolu s energiově disperzní analýzou (EDX). Parametry jako je porozita, botnací poměr, úbytek hmotnosti při degradaci ve vodném prostředí a v prostředí enzymů byly zjištěny vhodnými gravimetrickými metodami. Ovlivnění chemické struktury kolagenové matrice před a po přidání antibakteriálních aditiv bylo sledováno za pomocí metody zeslabeného úplného odrazu infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací (ATR FTIR). Procentuální uvolnění nanočástic z testovaných vzorků bylo sledováno pomocí optické emisní spektroskopie s indukčně vázanou plazmou (ICP OES). K zhodnocení antibakteriálních vlastností testovaných materiálů byly použity především difúzní agarová disková metoda a makrodiluční bujónová metoda. Provedeným výzkumem jsme zjistili vliv přídavku antibakteriálních činidel na strukturu a některé vlastnosti 3D kolagenových matric. Výsledky antibakteriálních testů ukázaly pozitivní vliv chitosanu i selenových nanočástic na inhibici růstu bakterií v závislosti na koncentraci přidaných aditiv. Navržené materiály mohou být využity pro biomedicínské aplikace především v oblastech zabývající se regenerací měkkých tkání.
|
guest ::
